对人类线粒体DNA进行高度均一的全基因组扩增

Features

克服了分离线粒体DNA耗时的问题

从总DNA中选择性扩增线粒体DNA

扩增得到多达4 µg的高纯度线粒体DNA

Product Details

REPLI-g Mitochondrial DNA Kit可从DNA样本中选择性扩增线粒体DNA，无需预先分离线粒体DNA。该试剂盒含有DNA聚合酶、缓冲液和试剂，可利用MDA技术从少量样本中的总DNA中特异性、均一的扩增人类线粒体DNA。这一简便的操作可富集线粒体DNA，且细胞核DNA污染最小，避免进行耗时的线粒体DNA分离纯化，提高了下游分析的灵敏度。

Performance

总DNA中一般含有大约0.1%的线粒体DNA（如：1 ng人类总DNA含有1 pg线粒体DNA）。REPLI-g Mitochondrial DNA Kit可以特异性扩增人类线粒体全基因组，50 µl反应体系可扩增获得大约4 µg高纯度线粒体DNA。这相当于4000万倍的扩增效果，依据起始量会有所不同。产物的平均长度一般长于10 kb。

Principle

常见的获得线粒体DNA的限制之一为需要将线粒体DNA与细胞核DNA分离，在需要提高线粒体DNA标记物分析的灵敏度时尤其如此。分离过程涉及很多耗时的步骤，有可能导致线粒体DNA的损失。REPLI-g Mitochondrial DNA Kit可在含有总DNA的样本中直接扩增获得线粒体DNA，解决了这一问题。

REPLI-g Mitochondrial DNA Kit可快速、高度均一的对线粒体基因组进行全基因组扩增。该方法基于MDA技术，采用新型独特进行性的DNA聚合酶进行等温基因组扩增。REPLI-g DNA Polymerase凭借其活跃的进行性置换反应，可扩增得到100 kb的DNA，无需预先分离DNA。与PCR扩增方法相比，这种方法能很大程度减小序列偏差和不均一位点的出现。

Procedure

使用REPLI-g Mitochondrial DNA Kit扩增线粒体DNA涉及两个基本的步骤。首先，将含有总DNA的样本置于REPLI-g mt Reaction Buffer中75°C孵育五分钟，使其变性；通过冷却，使变性停止。然后，加入REPLI-g DNA Polymerase，在33°C开始恒温扩增8小时。

Applications

REPLI-g技术扩增获得的线粒体DNA可用于多种下游应用，包括：

基因分型（例如：SNP、缺失、插入）

终点式PCR、real-time PCR 

测序

Supporting data and figures

Enrichment of mitochondrial DNA.

0.1 ng total DNA (representing approximately 15 cells) containing approximately 100 fg of mitochondrial DNA was amplified using the REPLI-g Mitochondrial DNA Kit. The total yield of mitochondrial DNA after amplification was up to 4 µg, corresponding to a 4 x 107-fold increase in mitochondrial DNA.

Specifications

Features                                            Specifications

Amplification                                    Whole genomic DNA

Samples per run (throughput)    Mid

Denaturation step                            Heat

Maximum input volume                    10 µl template DNA

Minimal pipetting volume needed    1 µl

Reaction volume                            50 µl

Reaction time                                    ~8 hours (overnight)

Quality assessment                             No

Applications                                     Genotyping, sequencing, RFLP

Starting amount of DNA                     ~10 ng purified total DNA

Starting material                             Genomic human DNA

Technology                                     Multiple Displacement Amplification (MDA)

Yield                                             ~4 µg